Автоантитела к Гармонину и Виллину являются диагностическими маркерами у детей с синдромом IPEX. геномед - анализы и цены
Состояния, вызванные нарушением клеточного иммунитета (дефект Т-клеток), являются тяжелыми комбинированными синдромами иммунодефицита . У некоторых пациентов эти формы иммунодефицита могут стать причиной развития крайне опасных заболеваний (вплоть до опасных для жизни), а у других - лишь небольшие проблемы со здоровьем. Остановимся подробнее на заболеваниях, которые развиваются при нарушении клеточного иммунитета.
Хронический кандидоз кожи и слизистых оболочек
Кандидоз (молочница) развивается при поражении кожи и слизистых грибковой инфекцией. Инфекция в редких случаях может распространиться на внутренние органы.Предрасположенность к развитию кандидоза существует при селективной недостаточности Т-клеток. Лечение кандидоза требует применения специальных противогрибковых препаратов (некоторым пациентам приходится проводить поддерживающую терапию в течение всей жизни).
Метафизарная хондродисплазия
Это заболевание является аутосомно-рецессивным иммунодефицитом. Распространено при близкородственных браках. Пациенты, страдающие метафизарной хондродисплазией имеют тонкие ломкие волосы и сильно восприимчивы к вирусным инфекциям. В некоторых случаях заболевание удается вылечить путем трансплантации костного мозга.Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром
Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром характеризуется повышенной уязвимостью к вирусу Эпштейна-Барр . Вирус Эпштейна-Барр может стать причиной развития опасных заболеваний (инфекционный мононуклеоз , апластическая анемия, рак лимфатических узлов, ветряная оспа , васкулит, герпес).Стоит отметить, что это заболевание наследуется только лицами мужского пола.
IPEX-синдром
IPEX-синдром (Х-сцепленная иммунодисрегуляция) может стать причиной развития различных аутоиммунных заболеваний (в частности, сахарный диабет), а также хронического поноса и экземы. От IPEX-синдрома страдают только лица мужского пола. Терапия IPEX-синдрома заключается в курсе иммунодепрессантов с последующей трансплантацией костного мозга. Результаты лечения, как правило, благоприятные.Веноокклюзионная болезнь печени
Веноокклюзионная болезнь печени - это чрезвычайно редкая форма иммунодефецита, которая наследуется аутосомно-рецессивным путем с нарушением обеих Т-клеток и В-клеток. Пациенты, страдающие этим иммунодефицитом, предрасположены к заболеванию грибковым инфекциям. Также у них может быть недостаточное количество тромбоцитов и увеличенная печень. Лечение заключается в трансплантации печени.Врождённый дискератоз
Этот синдром становится причиной развития микроцефалии и панцитопении. К сожалению, терапия этого заболевания крайне сложна и часто не помогает достичь излечения пациентом.Синдром ICF
Синдром ICF (синдром иммунодефицита, нестабильности центромерного участка и лицевых аномалий) наследуется от обоих родителей из-за дефектов в ДНК. У пациентов аномальные черты лица (макроглоссия), отмечается повышенная восприимчивость к бактериальным заболеваниям. Возможное лечение - трансплантация аллогенных стволовых клеток.Синдром Нетертона
Синдром Нетертона - это очень редкое заболевание с аутосомно-рецессивным наследованием. Пациенты имеют нормальное количество Т-клеток, но количество В-клеток у них снижено. Пациенты предрасположены к заболеваниюIPEX Синдром - это синдром иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии с Х-сцепленным рецессивным типом наследования (Immunodysregiilation, Polyendocrinopathy, and Enteropathy, X-Linked).
Симптомы: Полиэндокринопатия (нарушение в системе эндокринных желез), проявляющаяся развитием сахарного диабета 1 типа. При этом виде диабета иммунные клетки атакуют и уничтожают клетки поджелудочной железы, которые производят инсулин — гормон, участвующий в метаболизме (обмене) глюкозы (сахара) в организме. У пациентов с IPEX инсулин не вырабатывается, развивается состояние гипергликемии - повышенного содержания сахара в крови. Возможно также развитие аутоиммунного тиреоидита — воспаления щитовидной железы, вызванного атакой собственной иммунной системы, щитовидная железа больше не может должным образом выполнять свои функции (например, нарушается обмен кальция в организме). Энтеропатия (поражение желудочно-кишечного тракта) проявляется упорной диареей, начинающейся перед или во время употребления пищи, возможны кишечные кровотечения. Гемолитическая анемия - гемолиз (разрушение) эритроцитов и уменьшение количества гемоглобина. Кожные высыпания по типу экземы (коожная сыпь, сопровождающаяся зудом и шелушением). Артриты (воспаления суставов), лимфоаденопатия (увеличение и болезненность лимфатических узлов), поражение почек. Кахексия (крайняя степень истощения). Повышенная склонность к возникновению инфекций из-за наличия иммунной дисрегуляции (нарушения взаимодействия клеток иммунной системы между собой и с другими клетками) и/или нейтропении (уменьшения количества нейтрофилов — клеток иммунной системы, основная функция которых — это защита от инфекций): пневмонии (воспаления легких), перитонита (гнойного воспаления брюшины), сепсиса (заражения крови), септического артрита (гнойного воспаления суставов).
IPEX-синдром связан с мутациями в гене FOXP3
Метод исследования: секвенирование гена FOXP3
Autoantibodies to Harmonin and Villin Are Diagnostic Markers in Children with IPEX Syndrome
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3826762/
Задуманные и разработанные эксперименты: В.Л. Бози Р.Б. Провели эксперименты: CL E. Bazzigaluppi CB. Проанализированы данные: VL LP FB RB E. Bosi. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LP FB. Написал статью: Е. Бози. Способствовал написанию / редактированию рукописи: VL LP FB RB.
Аутоантитела к конъюнктивам энтероцитарных антигенов (75 кДа белка USH1C) и ворсин (актинсвязывающий белок 95 кДа) связаны с синдромом иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии, энтеропатии, X-связанного (IPEX). В этом исследовании мы оценили диагностическую ценность аутоантител гармоников и ворсинок в IPEX и подобных IPEX синдромах. Аутоантитела Harmonin и villin измерялись новым количественным анализом люминесцентной иммуно-осаждающей системы (LIPS) у пациентов с IPEX, синдромом, подобным IPEX, с первичными иммунодефицитами (PID) с энтеропатией, все диагностированными секвенированием гена FOXP3 и при диабете 1 типа (T1D), целиакии и здоровых донорах крови в качестве контрольных групп. Аутоантитела Harmonin и villin были обнаружены у 12 (92%) и 6 (46%) из 13 пациентов с IPEX, и ни у одного из пациентов с ИПЭКС, PID, T1D, целиакией, соответственно. Все пациенты ИПЭКС, в том числе один случай с поздним и нетипичным клиническим проявлением, имели либо аутоантитела с гармоникой и / или ворсинами, либо испытывали положительный результат на антитела к энтероцитам с помощью непрямой иммунофлуоресценции. При измерении у пациентов с IPEX при ремиссии после иммуносупрессивной терапии или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток аутоантитела гармоников и ворсинок во всех случаях становились необнаружимыми или сохранялись при низких титрах, но у одного, у которых аутоантитела гармоники оставались постоянно высокими. У одного пациента пик гармонических антител параллелен фазе рецидива энтеропатии. Наше исследование демонстрирует, что аутоантитела гармоников и ворсинок, измеренные LIPS, являются чувствительными и специфическими маркерами IPEX, дифференцируют IPEX, включая атипичные случаи, от других ранних детских расстройств, связанных с энтеропатией, и полезны для скрининга и клинического мониторинга затронутых детей.
Иммунная дисрегуляция, полиэндокринопатия, энтеропатия, синдром X-связанного (IPEX) — моногенное аутоиммунное заболевание, характеризующееся тяжелой энтеропатией, диабетом 1 типа (T1D) и экземой , . Синдром вызван мутациями в гене FOXP3, ответственным за серьезное нарушение регуляторных T (Treg) клеток . В то время как генетический анализ является выборным методом для конечного диагноза, нет четкой корреляции генотипа и фенотипа, и курс болезни варьируется у разных пациентов. Кроме того, несмотря на классификацию IPEX в качестве иммунодефицита, нет четких иммунологических параметров, предикторов тяжести заболевания или реакции на терапию — . Кроме того, нарушения с аналогичным клиническим фенотипом, называемые синдромами, подобными IPEX, могут существовать в отсутствие мутаций FOXP3, что создает трудности для клинического управления и выбора терапевтических средств — . Поэтому идентификация маркеров, специфически связанных с иммунной дисфункцией IPEX, была бы чрезвычайно полезной для диагностических целей. Циркулирующие энтероцитарные аутоантитела, обнаруженные с помощью косвенной иммунофлюоресценции, были описаны в прошлом в связи с различными энтеропатиями, в том числе в конечном итоге идентифицированными как синдром ИФЕКС , но молекулярные мишени этих серологических маркеров давно неизвестны. Различный энтероцитарный аутоантиген, распознаваемый сыворотками пациентов с IPEX, затем идентифицировался как белок AIE-75 75 кДа , и далее характеризовался как белок синдрома Usher Syncrome (USH1C), также известный как гармоник , белок, который, как сообщается, является частью супрамолекулярных белковых сетей, связывающих трансмембранные белки с цитоскелетом в фоторецепторных клетках и волосковых клетках внутреннего уха . Аутоантитела к гармонину (HAA), обнаруженные методом иммуноблоттинга и радиолиганда, были зарегистрированы у пациентов с IPEX и у небольшой части пациентов с раком толстой кишки . Совсем недавно актинсвязывающий белок, обозначенный актином 95 кДа, участвующий в организации актинового цитоскелета на границе кисти эпителиальных клеток , был описан как дополнительная мишень аутоантител у части пациентов с ИПЭКС . Напротив, насколько нам известно, ни одна информация не сообщалась ни о HAA, ни аутоантителах ворсинок (VAA) в синдромах, подобных IPEX, первичных иммунодефицитах (PID) с энтеропатией или при нарушениях, часто связанных с IPEX, таких как T1D и аутоиммунные энтеропатии разных происхождение.
Целью этого исследования было разработать количественные анализы для измерения HAA и VAA на основе недавно разработанной Luminescent Immuno Precipitation System (LIPS) , определить их диагностическую точность в IPEX, IPEX-подобных и PID-синдромах, оценить их в соответствии с антителами энтероцитов, испытанными иммунофлюоресценцией, и оценивают их ценность в клиническом наблюдении пациентов ИПЭКС.
Тринадцать пациентов с IPEX и 14 пациентов с синдромом, подобным IPEX, были протестированы в LIPS для присутствия HAA и VAA. В качестве контрольных групп мы исследовали 5 пациентов с PID различного происхождения [два с дефицитом CD25, два с синдромом Вискотта Олдрича (WAS)) и один с аденозиндезаминазой с дефицитом тяжелой комбинированной иммунодефицита (ADA-SCID), все состояния, характеризующиеся ранней энтеропатией начала] , 123 с T1D, 70 с целиакией и 123 здоровыми донорами крови. Диагноз IPEX основывался на клинических и молекулярных результатах в соответствии с критериями, установленными Итальянской ассоциацией детской гематологии и онкологии (AIEOP, www.AIEOP.org). Мутации и клинические данные пациентов с ИПЭКС и ИПЭКС приведены в таблицах S1 и S2 соответственно. Все пациенты с IPEX, за исключением Pt19, Pt21, Pt22 и Pt24, были описаны в предыдущих публикациях , — . PT24 представлен атипичной формой заболевания, характеризующейся поздним началом, без признаков энтеропатии, но сильным гастритом в присутствии воспалительных инфильтратов слизистой оболочки, связанных с атрофией ворсинок. Общий уровень IgG был доступен у 10 из 13 исследованных пациентов из IPEX: из них 8 были в нормальном диапазоне по возрасту (только с одним пациентом при внутривенном (IV) Ig-терапии), тогда как в двух случаях они были слегка увеличены. Пациенты с диагнозом IPEX-подобного синдрома имели клинические проявления IPEX, но тестировали отрицательный результат на мутации в гене FOXP3. Пациенты, подобные IPEX, представили по крайней мере одну из основных клинических особенностей IPEX (аутоиммунная энтеропатия и / или T1D), связанная с одним или несколькими из следующих аутоиммунных или иммунных опосредованных заболеваний: дерматит, тиреоидит, гемолитическая анемия, тромбоцитопения, нефропатия, гепатит, алопеция, гипер IgE с или без эозинофилии. Клинические и лабораторные параметры позволили исключить другие моногенные заболевания, такие как WAS, синдром Оменна, синдром гипер IgE и аутоиммунный лимфопролиферативный синдром. По крайней мере, один образец сыворотки у пациентов с IPEX и подобными IPEX синдромами был доступен для аутоантительных анализов во время диагностики. В шести пациентах IPEX несколько образцов сыворотки были также получены во время клинического наблюдения и использованы для дополнительных измерений аутоантител, для изучения корреляции с клиническим исходом заболевания (образцы Pt12:8 от рождения до 8 лет, Pt14:7 образцы от 6 месяцев до 13 лет, образцы Pt17-3, от 4 месяцев до 3,5 лет, образцы Pt19:44 от 4 месяцев до 2 лет, образцы Pt22:3 от 0 до 5 месяцев; Pt 23:44 от 4 до 10 лет). Все пациенты с PID были диагностированы на основе молекулярного тестирования. Пациенты с T1D были все недавние случаи, с диагнозом, основанным на критериях Американской диабетической ассоциации ; пациенты с целиакией были изучены во время диагноза, основанного на биохимии тощей кишки.
Согласно заявлению Хельсинки, каждому пациенту и ближайшим родственникам, опекунам или опекунам было предоставлено письменное информированное согласие от имени несовершеннолетних / детей, участвующих в этом исследовании. Исследование было одобрено местным научно-исследовательским комитетом по этике в Сан-Раффаэле.
Все пациенты, классифицированные как имеющие IPEX или IPEX-подобный синдром, были введены для мутаций FOXP3. Геномную ДНК выделяли из периферической крови с использованием метода фенол-хлороформ или набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), следуя инструкциям производителя. Одиннадцать экзонов, включая все границы интрон-экзонов, были амплифицированы из геномной ДНК с помощью ПЦР с конкретными фланкирующими парами интронного праймера. Фрагменты амплифицированных генов были секвенированы с использованием набора для циклического циклирования BigDye Terminator (Applied Biosystems) на автоматизированном генетическом анализаторе ABI PRISM 3130xl и генетическом анализаторе ABIPRISM 3730 (Applied Biosystems).
Кодирующую последовательность люциферазы Рениллы клонировали в плазмиду pTnT (Promega, Милан, Италия) для генерации вектора pTnT-Rluc. Затем полноразмерные гармонические и ворсинцевые ДНК-кодирующие последовательности амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР и клонировали отдельно в pTnT-Rluc ниже по течению и в рамке с люмиферазой Renilla. Рекомбинантный химерный Rluc-Harmonin и Rluc-Villin экспрессировали in vitro -связанной транскрипцией и трансляцией с использованием системы свободных клеток лизата кроличьего ретикулоцита pTnT-quick SPM (Promega). Для тестирования на присутствие HAA или VAA Rluc-Harmonin и Rluc-Villin использовали в качестве антигенов в LIPS (17), инкубируя 4 × 106 световых единиц эквивалентов с 1 мкл сыворотки каждого пациента в PBS ph 7.4-Tween 0,1% (PBST) в течение 2 часов при комнатной температуре IgG-иммунные комплексы выделяли путем добавления белка-A-сефарозы (GE Healthcare, Милан, Италия) с последующей инкубацией 1 ч при 4 ° С и промыванием PBST несвязанного Ag путем фильтрации в 96-луночных фильтровальных пластинах Costar 3504 (Corning Life Sciences, Тьюксбери, США). Иммунопреципитированные антигены затем определяли количественно путем измерения восстановленной активности люциферазы после добавления субстрата люмиферазы Renilla (Promega) и измерения излучения света в течение 2 секунд в люминометре Centro XS3 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG, Bad Wildbad, Germany). Результаты были выражены в произвольных единицах, полученных либо из индекса антител (ВАА) с использованием положительной и отрицательной сыворотки в соответствии с формулой (контрольная сыворотка cps-cps-отрицательная сыворотка) / (cps-положительная сыворотка-сп-отрицательная сыворотка) x100, либо из стандартная кривая (HAA), состоящая из серийных разведений положительной исходной сыворотки. Отсечение положительности было поставлено на 99-й процентиль значений, наблюдаемых у здоровых доноров крови, как обычно принято в семинарах для оценки чувствительных к Т1D аутоантител, анализирующих чувствительность и специфичность .
Энтероцитарные аутоантитела определяли в IPEX и IPEX-подобных группах пациентов путем косвенной иммунофлюоресценции на участках криостата нормальной тощей кишки человека или обезьяны, как описано ранее .
Маркеры аутоантител T1D и целиакии, включая антитела к декарбоксилазе глутаминовой кислоты (GADA) , связанный с инсулиномой белок 2 , инсулин , цинк-транспортер 8 и трансглутаминаза-C , были измеренный во всех IPEX, IPEX-подобных, PID, T1D, целиакии и здоровых группах контроля донора путем иммунопреципитации с использованием LIPS или радиообъектива, как описано ранее. Все результаты были выражены в произвольных единицах, полученных из стандартных кривых, полученных путем серийного разбавления положительных исходных сывороток.
В этом исследовании использовалась только описательная статистика. Расчет 99-й процентиль произвольных единиц у доноров крови для выбора порога проводился с использованием Stata (StataCorp LP, США). Условная вероятность тестирования положительной (чувствительности) или отрицательной (специфичности) для HAA или VAA в зависимости от наличия или отсутствия состояния болезни IPEX и соответствующих доверительных интервалов 95% была рассчитана с использованием веб-сайта Vassar Stats для статистических вычислений (http: / /vassarstats.net/clin1.html). Корреляция между титрами HAA и VAA была основана на критериях корреляции рангов Spearman и была рассчитана с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5.
Повышенные концентрации циркулирующего HAA были обнаружены у 12 из 13 (92%) пациентов с IPEX, в то время как они были отрицательными у пациентов с ИПЭКС, PID, T1D и целиакией (рис.1A). Повышенные концентрации циркулирующих VAA были обнаружены у 6 (46%) пациентов IPEX (Pt19, Pt14, Pt12, Pt17, Pt3, Pt21, причем последние четыре имели титры, равные или превышающие 98 VAA AU), включая пациента без HAA (Pt17), тогда как VAA были отрицательными в IPEX-подобных и других группах контроля заболеваний (фиг.1B). Все пациенты с IPEX были положительными либо для HAA, либо для VAA, что давало комбинацию HAA и VAA тест-чувствительность 100% (95% ДИ: от 71,6 до 100%) и специфичность теста 97,6% (95% ДИ: 92,5 до 99,4%) для диагностики синдрома IPEX. Никакие клинические или фенотипические характеристики не коррелировали с наличием либо аутоантител у пациентов с IPEX. Значительной корреляции не наблюдалось у пациентов с ИПЭКС между титанами аутоантител к ААА и VAA (Spearman r = -0,3 p = ns). GADA, как наиболее распространенные аутоантитела T1D, были обнаружены у пациентов с IPEX (9 из 13, 5 с T1D), синдром типа IPEX (4 из 14, 2 с T1D) и PID (3 из 5, 1 с T1D) (фиг.1C). Другие аутоантитела T1D были обнаружены в более низких пропорциях, в том числе аутоантитела к инсулину в 5 IPEX, 4 IPEX-подобных и 2 PID и автоантитела Zinc Transporter 8 у одного пациента IPEX. Не наблюдалось корреляции между титрами GADA и HAA или VAA (Spearman r = -0,017 p = ns и r = 0,34 p = ns, соответственно). Ни у одного из пациентов с ИПЭКС, ИПЭКС-подобным синдромом или ПИД не было связанных с целиакией аутоантител трансглутаминазы-С ткани IgA или IgG (данные не показаны).
HAA (панель A), VAA (панель B) и GADA (панель C) титры сывороточного IgG, выраженные в произвольных единицах в IPEX (n = 13), IPEX-like (n = 14), PID (n = 5), T1D (VAA и GADA n = 123, VAA n = 46), пациентов с целиакией (HAA n = 70, VAA n = 46, GADA n = 44) и в контроле (HAA и VAA n = 123, GADA n = 67). Пунктирная линия указывает на отсечку для положительности.
Все сыворотки IPEX, но одна (Pt 22), 10 IPEX-like и 3 PID-сыворотки были протестированы на антитела энтероцитов иммунофлуоресценцией на секциях криостата кишечника. Все испытуемые пациенты ИПЭКС были положительными для энтероцитарных антител. HAA положительные сыворотки показали сильную реакционную способность против кишечной энтероцитов кишечника и цитозоля с наибольшей интенсивностью на границе кисти (рис. 2А). Изолированный высокий титр VAA показал сильное окрашивание, чтобы очистить границу, но не цитозоль (рис.2B). Вне группы пациентов IPEX только одна сыворотка от пациента с ПИД-инфекцией с мутацией гена CD25 и отрицательная для HAA и VAA (Pt L1) показала положительное окрашивание энтероцитов, ограниченных границю кисти (рис. 2C).
HAA от IPEX Pt 19 связывает границу кисти и цитозоль энтероцитов (панель A), в то время как VAA от IPEX Pt 17 связывает только границу кисти (панель B). IgG из PID Pt L1 связывают границу кисти энтероцитов (панель C). Отсутствие связывания в IPEX-подобных Pt L30 (панель D).
Последовательные образцы для измерений HAA и VAA были доступны для 6 пациентов с IPEX (Pt12, Pt14, Pt17, Pt19, Pt22 и Pt23): все они подверглись трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) в качестве лечебной терапии, предшествующей в 4 случаях переменной период системной иммуносупрессии. Во время этого отчета (апрель 2013 г.) все, кроме двух трансплантированных пациентов были живы, в клинической ремиссии от их энтеропатии и не принимали иммуносупрессивную терапию (таблица S1). Генетический анализ периферической крови, собранной после трансплантации, показал 100% -ный донорный химеризм в 4 случаях (Pt12, Pt14, Pt19 и Pt22) и смешанный химеризм донора / реципиента у других пациентов. В начале энтеропатии у трех пациентов были как HAA, так и VAA (Pt12, Pt14 и Pt19), у одного был только VAA (Pt17), а два имели только HAA (Pt22 и Pt23) (фиг.3). В пяти случаях (Pt12, Pt14, Pt17, Pt22 и Pt23) клиническая ремиссия или заметное улучшение после либо иммуносупрессии, либо HSCT сопровождалась уменьшением как HAA, так и / или VAA титров, которые становились необнаружимыми или сохранялись при очень низких титрах в четырех случаев с самым продолжительным наблюдением. В одном случае (Pt19) после того, как HSCT VAA стал необнаружимым, в то время как HAA сохранялся при высоких титрах, несмотря на клиническую ремиссию (рис. 3D). По меньшей мере в одном случае (Pt14) HAA оказался чувствительным маркером энтеропатии: HAA были обнаружены при высоких титрах в сочетании с тяжелой энтеропатией во время диагностики IPEX, а затем уменьшались во время клинической и гистологической ремиссии после иммуносупрессивной терапии, достигла максимума во время клинического рецидива, а затем стала настойчиво необнаруживаемой после успешной HSCT и клинической ремиссии (фиг.3B). Несмотря на меньшую распространенность, VAA показала модель, аналогичную модели HAA. Падение аутоантител, наблюдаемое после HSCT, было вызвано недостаточностью В-клеток и IgG, вторичной по отношению к кондиционированию. Действительно, за исключением Pt22, у которого была короткая послеоперационная пересадка, все пациенты со сниженными титрами HAA или VAA после HSCT (Pt12, 17 и 23) уже были иммунизированы и IVIg-терапия была независимой во время первого после HSCT.
На вертикальной оси обозначены HAA (бриллианты) и VAA (треугольники), титры аутоантител, выраженные в произвольных единицах, по времени горизонтальной оси в месяцах. Вертикальная пунктирная линия указывает дату HSCT, горизонтальные пунктирные и пунктирные линии указывают на отсечку для положительности HAA и VAA, соответственно.
В этом исследовании мы показываем, что HAA и VAA, легко измеряемые новыми анализами LIPS и используемые в комбинации, являются высокочувствительными и специфическими маркерами синдрома IPEX и могут прогнозировать его клинический результат. Фактически, у всех пациентов с IPEX с диагнозом, подтвержденным генетическим тестированием, были повышенные концентрации HAA или VAA. Напротив, ни один из пациентов с энтеропатией без мутаций FOXP3 (например, IPEX-like или PID), пациенты с T1D или целиакией были положительными ни для HAA, ни для VAA. Из двух маркеров у HAA была самая высокая чувствительность, обнаруженная у 12 из 13 пациентов с IPEX, тогда как VAA были обнаружены только у шести из них. Примечательно, что HAA и VAA оказались ценными маркерами синдрома IPEX также в нетипичных случаях, таких как Pt24, где энтеропатия не была частью клинического проявления, вместо этого доминировал сильный гастрит, у которого подозревался IPEX, а затем подтвержден геном FOXP3 секвенирование только после обнаружения повышенного HAA. В будущем новый анализ LIPS позволит более систематизировать скрининг HAA и VAA у пациентов с гетерогенными клиническими синдромами, с возможностью выявления большего числа случаев клинически нетипичных синдромов IPEX.
GADA были второй по частоте реакцией аутоантител, наблюдаемой у пациентов с IPEX после HAA. Хотя GADA являются наиболее распространенным маркером аутоантител T1D, с широким диапазоном титра во время клинического начала , они не всегда связаны с диабетом. Фактически, они могут быть обнаружены и при других аутоиммунных заболеваниях, включая синдром Жесткого человека и аутоиммунную полиэндокринопатию (APS). Интересно, что у пациентов с АФП ГАДА больше коррелируют с развитием желудочно-кишечных симптомов, а не с диабетом . Интригующе, также у наших пациентов с IPEX, GADA были в основном распространены, не будучи неизменно связанными с T1D.
В дополнение к тому, чтобы быть точными маркерами синдрома IPEX, HAA и VAA могут иметь потенциальную прогностическую ценность, особенно в отношении связанной с этим энтеропатии. В шести пациентах с имеющимися пробами после пробы были выявлены высокие титры как HAA, так и VAA во время диагностики или в начале желудочно-кишечных симптомов и до начала лечения. После этого в пяти случаях после иммуносупрессивного лечения и / или HSCT (Pt12, Pt14, Pt17, Pt22 и Pt23) титры HAA и VAA снижались, становясь необнаружимыми или сохранялись при низких титрах вокруг порога обнаружения, что отражает клиническую и гистологическую ремиссию ассоциированная энтеропатия. В одном из них (Pt14) временный рецидив энтеропатии, возникающий во время иммуносупрессивного лечения, сопровождался пиком HAA с последующим падением после клинической ремиссии. К сожалению, у этого пациента отсутствие последовательных образцов не позволило нам зафиксировать сроки увеличения аутоантител, предшествующие рецидиву энтеропатии. В одном случае (Pt19) клиническая ремиссия сопровождалась снижением VAA, но не HAA, которое сохранялось при высоких титрах до 15 месяцев после HSCT. Обнаружение снижения титров HAA и VAA после HSCT у большинства, но не у всех пациентов, чрезвычайно интригует, возможно, связано с выживаемостью остаточных лимфоцитов хозяина или плазмоцеллов, ответственных за стойкое продуцирование этих аутоантител.
Введение этих маркеров аутоантител в клиническую практику было бы относительно простым, учитывая легкость их измерения с помощью недавно разработанного LIPS. Недавно эта технология была предложена в качестве новой нерадиоактивной процедуры для замены радиоактивного антитела и иммунопреципитации белков-А в золотом стандарте in vitro транскрибированных и переведённых меченых 35S-метионином рекомбинантных человеческих антигенов, подтвержденных с помощью установленных программ стандартизации аутоантител как в T1D , и целиакии . В последних отчетах LIPS продемонстрировал показатели, сравнимые с показателями анализов на радиосвязь и выше, чем ранее существовавший ELISA , . В этом исследовании LIPS был разработан с использованием рекомбинантной химерной люмиферазы Renilla (Rluc) -Harmonin и Rluc-Villin в качестве антигенов, что приводит к анализу с низким фоновым шумом и линейными количественными измерениями аутоантител, способными отличить положительные результаты от отрицательных образцов сыворотки. Таким образом, измерение HAA и VAA с помощью LIPS оказалось быстрым, простым и воспроизводимым тестом, легко применимым для клинического применения.
Интересно, что те же диагностические показатели комбинированных HAA и VAA наблюдались с энтероцитарными аутоантителами, обнаруженными традиционной непрямой иммунофлюоресценцией. Также остается неясным, но стоит проверить в будущем, являются ли гармоники и ворсины единственными антигенами, признанными на энтероцитах с помощью IPEX-ассоциированных аутоантител, или если еще не идентифицированы другие цели аутоантигена энтероцитов ассоциированных с IPEX антител.
До сих пор IPEX считался Т-клеткой, а именно иммунной болезнью Treg-клетки-дисфункции , , , при ограниченном внимании к связанным дефектам гуморального иммунного ответа: наши результаты подчеркивают ассоциацию основных мутаций гена FOXP3 с надежным и количественно измеряемым антигенспецифическим аутоантителом. Однако, поскольку В-клетки не экспрессируют FOXP3, мутации FOXP3 вряд ли окажут непосредственное влияние на развитие В-клеток и / или производство антител. Тем не менее, недавние исследования показывают, что В-клетки могут быть как прямыми, так и непрямыми мишенями подавляющей функции, опосредуемой клетками Treg , , а изменение клеток Treg влияет на титры аутоантител как в мышиных моделях, так и у людей — , Более того, прямые данные, полученные с мышей с мутантами foxp3, указывают на то, что отсутствие клеток Treg связано с аномальным развитием В-клеток, потерей аллергии В-клеток и развитием долгоживущих плазматических клеток , . Кроме того, недавно было продемонстрировано, что у людей дефицит FOXP3 приводит к накоплению аутореактивных клонов в зрелом наивном отделении В-клеток, что указывает на важную роль клеток Treg в контроле контрольной точки с точки зрения периферической B-клетки .
Механизмы, ответственные за аутоиммунизацию гармонов и ворсинок в IPEX, и роль этих аутоантигенов в патологических проявлениях синдрома IPEX остаются неизвестными. Гармонин выражен в нескольких тканях, включая тонкую кишку, ободочную кишку, почку, глаз, вестибюль внутреннего уха и, слабо, поджелудочную железу. В кишечнике экспрессия гармонизатора преимущественно обнаруживается в эпителиальных клетках поверхности просвета и в верхней половине кишечных крипт — и, вероятно, локализована в микровиллеях кисти ; аналогичная локализация была показана для ворсинок , . Учитывая, что основной гистопатологической особенностью энтеропатии IPEX является атрофия ворсинок с апоптотической гибелью клеток кишечных эпителиальных клеток в сочетании с умеренным или выраженным воспалением , вполне вероятно, что в этом контексте гармоник и ворсин могут действовать как соответствующие молекулярные мишени патогенная аутоиммунитет.
Это исследование показало, что HAA и VAA, измеренные LIPS, являются точными диагностическими маркерами синдрома IPEX, со 100% -ным соответствием мутаций гена FOXP3, которые дифференцируют IPEX, включая атипичные случаи, от других детских нарушений, связанных с энтеропатиями. В целом, эти данные показывают, что HAA и VAA следует включать в диагностический поток и клиническое наблюдение за пациентами с синдромом IPEX, у которых изменения титров HAA и VAA, свидетельствующие о рецидивах энтеропатии, могут помочь клиницистам принимать быстрые терапевтические решения.
Клинические особенности пациентов ИПЭКС.
Клинические особенности пациентов, подобных ИПЭКС.
Щелкните здесь для получения дополнительных данных.
Авторы признательны своим коллегам, которые любезно предоставили образцы сыворотки и клиническую информацию об их пациентах с IPEX и IPEX: E. S. Kang и Y. H. Choe, Seoul, Republic of Korea; Г. Цуин, Милан, Италия; A. Staiano, R. Troncone и V. Discepolo, Неаполь, Италия; J. Schmidtko, Berne, Switzerland; A. IkinciogullariZ. СедаУйан, М. Айдоган, Э. О. Цзу, Анкара, Турция; G.R. Corazza и R.Ciccocioppo, Павия, Италия; S. Vignola, Генуя, Италия; А. Бильбао и С. Санчес-Рамон, Мадрид, Испания; J. Reichenbachand M. Hoernes, Цюрих, Швейцария; M. Abinun и M. Slatter, Newcastle upon Tyne, U.K .; М. Чиполли, Верона, Италия; Ф. Гуракан, Анкара, Турция; Ф. Локателли и Б. Лукарелли, Рим, Италия; C. Cancrini и S. Corrente, Рим, Италия; А. Томмазини, Триест, Италия; Л. Гуиди, Рим, Италия; Э. Ричмонд Падилья и О. Поррас, Сан-Хосе, Коста-Рика; С. Мартино и Д. Монтин, Турин, Италия; М. Хаушильд, Германия; K. Nadeau и M. Butte, Stanford, CA; A. Aiuti, G. Барера, Ф. Мески и Р. Бонфанти, Милан, Италия. Авторы также благодарят: M. Cecconiand D. Coviello для генотипирования FOXP3; и членов итальянской исследовательской группы IPEX (www.ipexconsortium.org) Р. Бадолато, М. Чеккони, Г. Коларуссо, Д. Ковиелло, Э. Гамбинера и А. Томмазини за поддержку и поддержку. Авторы благодарны пациентам и их семьям за их доверие и участие в наших исследованиях.
Х-сцепленный синдром иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии (Immunodysregiilation, Polyendocrinopathy, and Enteropathy, X-Linked - IPEX) является редким тяжелым заболеванием. Впервые он описан более 20 лет назад в большой семье, где было выявлено сцепленное с полом наследование.
Патогенез Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии
Было показано, что IPEX развивается в результате нарушения регуляции функций CD4+ клеток в виде повышения активности Т-клеток и гиперпродукции цитокинон. Моделью IPEX являются «Scurfy» мыши (sf). Заболевание у них является Х-сцепленным и характеризуется поражением кожи, задержкой развития, прогрессирующей анемией, тромбоцитопенией, лейкоцитозом, лимфаденопатией, гипогонадизмом, инфекциями, диареей, кишечными кровотечениями, кахексией и ранней гибелью. При иммунологических исследованиях выявлены повышение активности CD4+ клеток, гиперпродукция цитокинов (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, INF-Y, и TNF-a). В 2001 у мышей была выявлена мутация гена f0хр3. Этот ген кодирует протеин - scurfin, участвующий в регуляции транскрипции генов.
Ген f0xp3, ответственный за развитие IPEX картирован на Xp11.23-Xq13.3 недалеко от гена WASP. Он специфически экпрессируется СD4+СD25+ регуляторными Т-клетками. У пациентов с IPEX выявлены мутации этого гена.
В норме аутореактивные Т- и В-клетки подвергаются клепальной элиминации в процессе созревания. Наряду с пассивными механизмами аутотолерантности в этом процессе участвуют регуляторные CD4+ Т-клетки (Тя клетки), которые поддерживают периферическую аутотолерантность супрессируя активацию и экспансию аутореактивных Т-лимфоцитов. Большинство, CD4+ Тr клеток конституционально экспрессирует CD25.
f0xp3 ген, кодирующий scurfin протеин, который тормозит транскрипцию специфически экспрессируется на CD25+ CD4+ r-клетках в тимусе и на периферии. CD25+ CD4+ Tr клетки являются популяцией функционально зрелых лимфоцитов, распознающих широкий спектр «собственных» и «чужеродных» антигенов. Отсутствие Тr в тимусе ведет к развитию аутоиммунных заболеваний. Показано, что CD25+ CD4+ Т-клетки периферической крови экспрессируют f0xp3 и способны супрессировать активацию и экспансию других Т-клеток. Активация CD25-CD4+ T клеток посредством стимуляции TCR индуцирует экспрессию f0xp3, a f0xp3+ CD25- СD4+ Т клетки обладают такой-же супрессорной активностью, как CD25+CD4+ Tr CD25- Tr клетки могут становиться CD25+ после стимуляции антигеном.
Симптомы Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии
Основными симптомами Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии являются эдокринопатии, целиак-негативная энтеропатия, экзема, аутоиммунная гемолитическая анемия. Клинические проявления развиваются, как правило, в перинатальном периоде или первые месяцы жизни. Описаны единичные случаи «позднего начала» IPEX (после первого года жизни и даже у взрослых).
Обычно первыми симптомами Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии являются сахарный диабет 1 типа и энтеропатия, представленная секреторной диареей или илеусом. У пациентов с диабетом, несмотря на применение инсулина трудно достичь состояния эугликемии. Причиной диабета при IPEX является разрушения островковых клеток вследствие воспаления, а не их агенезия, как предполагалось ранее. Диарея иногда развивается до начала кормления, и всегда нарастает на фоне кормления, часто приводя к невозможности применения энтерального питания. Применение аглиадиновой диеты в большинстве случаев неэффективно. Нередко диарея сопровождается кишечными кровотечениями.
Другие клинические симптомы Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии проявляются преимущественно у пациентов, старше трех лет. Как уже было указано выше, они включают экзему (эксфолиативный или атонический дерматит), тромбоцитопению, Кумбс-позитивную гемолитическую анемию, аутоиммунную нейтропению, лимфаденопатию, гипотиреоз. У больных, не страдающих сахарным диабетом, часто развивается полиартрит, астма, язвенный колит, мембраноэная гломерулонефропатия и интерстициальный нефрит, саркоидоэ, периферическая полинейропатия.
Инфекционные проявления (сепсис, в том числе катетер-ассоциированный, перитонит, пневмонии, септический артрит) не всегда являются осложнением иммуносупрессивной терапии. Основными возбудителями инфекций являются Enterococcus и Staphylococcus aureus. Причинами повышенной склонности к инфекциям могут быть иммунная дисрегуляция и/или нейтроппения. Наличие энтеропатии и поражения кожи способствуют инфицированию.
Задержка роста может начаться антенатально, и кахексия является частым признаком синдрома IPEX. Ока развивается вследствие нескольких причин: энтеропатии, плохо контролируемого сахарного диабета, повышенного высвобождения цитокинов.
Наиболее частыми причинами гибели пациентов являются кровотечения, сепсис, неконтролируемая диарея и осложнения сахарного диабета. Фатальные исходы нередко ассоциированы с вакцинацией, вирусными инфекциями и другими экзогенными иммуностимулирующими воздействиями.
Лабораторные показатели Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии
Соотношение CD4+/CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови нормально у большинства пациентов. Количество HLA-DR+ и CD 25+ Т-клеток повышено. Пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены слегка понижен или нормален. Стимуляция лимфоцитов митогенами in vitro приводит к повышенной экспрессии IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и пониженной экспрессии INF-y. У большинства пациентов концентрации сывороточных иммуноглобулинов IgA, IgG и IgM-нормальны, только в единичных случаях выявлена гипогаммаглобулинемия, пониженная продукция специфических антител после вакцинации, и снижение пролиферативной активности Т-клеток. Концентрация IgE повышена. Часто выявляется эоэинофилия. Аутоантитела обнаружены у большинства пациентов, это антитела к островковым клеткам поджелудочной железы, инсулину, декарбоксилззе глютаминовой кислоты (glutamic acid decarboxylase - GAD), гладкой мускулатуре, эритроцитам, интестинальному эпителию, глиадину, антигенам почек, тиреоидным гормонам, кератиноцитам.
При гистологическом исследовании выявляется атрофия слизистой кишечника, инфильтрация собственной пластинки и подслизистого слоя воспалительными клетками. Воспалительная инфильтрация присутствует во многих органах. В поджелудочной железе - очаги воспаления и уменьшение количества или отсутствие островковых клеток; в печени - холестаз и жировая дистрофия; в коже - инфильтрация иммунными клетками и изменения характерные для псориаформной дисплазии; в почках - тубулоинтерстициальный нефрит, фокальная тубулярная аплазия, мембранозная гломерулопатия и гранулярные иммунные депозиты в базальных мембранах клубочков и канальцев.
Лечение Х-сцепленного синдрома иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии
Постоянная иммуносупрессивная терапия, включающая циклоспорин А, такролимус, кортикостероиды, инфликсимаб и ритуксимаб оказывает положительный эффект у части больных. Длительное применение такролимуса ограничено в связи с токсичностью. В большинстве случаев, несмотря на лечение, заболевание продолжает неуклонно прогрессировать.
Трансплантация стволовых клеток была выполнена всего нескольким пациентам, и имеющиеся результаты не позволяют судить об ее эффективности при IРЕХ синдроме.
